qPCR这件“小”事儿 | 台灣精品獎-歷屆得獎名單
2020年12月2日—荧光定量PCR(RealtimefluorescencequantitativePCR,qPCR)也称作实时...溶解曲线:熔解曲线(Meltingcurve)是指随温度升高DNA的双螺旋结构降解 ...
荧光定量 PCR(Realtime fluorescence quantitative PCR,qPCR)也称作实时荧光定量 PCR。常被大家叫做qPCR。顾名思义,qPCR能够对起始样本精准定量分析的技术。被广泛的应用于分子生物学以及医学的各个领域,大家一起来了解下吧!
qPCR原理
将荧光基团加入到PCR的整个反应体系中,在PCR反应过程中产物逐渐积累,荧光信号强度也会随之等比例增加。每经过一个PCR循环会收集到一个荧光信号,通过荧光强度变化进而检测产物量的变化,最终仪器上得到一条荧光扩增曲线图,图中横坐标表示循环数,纵坐标表示荧光强度。
qPCR 扩增曲线图
我们在扩增曲线中看到几个名词,来分别看看他们的意思吧。
荧光扩增曲线可以分为一下三个阶段:荧光背景信号阶段(基线期)、荧光信号指数扩增阶段和平台期。基线期,扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖,无法判断产物量的变化;而在平台期,扩增产物不再呈指数级的增加,PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系,根据最终的 PCR 产物量也不能计算出起始DNA拷贝数;只有在指数期,也就是荧光信号指数扩增阶段,PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系,最适合进行样本原始样本量分析。
基线:在 PCR 的最初几个循环中(一般为 3-15 个循环)的信号水平。此阶段的荧光信号变化量极小,接近一条直线,低水平的基线信号相当于反应的背景或噪声。每个实时荧光定量 PCR 反应的基线应通过用户分析或扩增曲线自动分析。
荧光阈值:一般将PCR 反应前15个循环的荧光...
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